NanoKon

NanoKON – Systematische Bewertung der Gesundheitsauswirkungen nanoskaliger Kontrastmittel

Ziel des Vorhabens war die Abschätzung der gesundheitlichen Auswirkungen von nanoskaligen Kontrastmitteln, die oral verabreicht werden. Dazu wurden im Verlauf des Vorhabens nanoskalige Partikel hergestellt und zusammen mit kommerziell erhältlichen Referenzpartikeln in einer Vielzahl von in vitro, in vivo und in silico Untersuchungen eingesetzt.

Alle verwendeten Nanomaterialien wurden im Rahmen des AP 1 einer eingehenden Grundcharakterisierung unterzogen, wobei auch spezielle Eigenschaften wie zum Beispiel Ionenfreisetzung toxisch relevanter Spezies (Ba, Gd) in künstlichem Magensaft untersucht wurden. Da die meisten zur Verfügung stehenden Partikelsysteme (kommerziell erhältlich auch in Eigensynthese hergestellt) die wechselnden Bedingungen (pH, hohe Ionenstärke) schlecht tolerierten, wurde für die Mehrzahl der Systeme eine Agglomeration unter diesen Bedingungen beobachtet. Arbeiten zur Modifikation der Partikeloberfläche erfolgten im Projektverlauf mit dem Ziel, möglichst stabile und hinsichtlich ihrer Abbildbarkeit funktionelle Suspensionen herzustellen.

In AP 2 und AP 3 wurden in vitro Untersuchungen der Nanopartikel an relevanten Zelllinien und Barriere-Modellen durchgeführt. Ziel war es hier, die Aufnahme und den Verbleib der Kontrastmittel in relevanten Systemen zu untersuchen, die bei oraler Gabe mit den Kontrastmitteln in Kontakt kommen. Ein weiterer Aspekt waren Untersuchungen zur Adsorption von umgebenden Proteinen auf der Oberfläche des Kontrastmittels unter Bildung einer Protein-Korona. Übereinstimmend konnte eine Aufnahme der verwendeten Kontrastmittel (Fe_xO_y und Fe_xO_y@SiO₂) bzw. SiO₂ Nanopartikel (Referenzoberfläche) in Darmepithelzellen, Endothelzellen und Makrophagen festgestellt werden. Eine Aufnahme der Partikel konnte in einigen Beispielen bereits nach 15-30 min detektiert werden. Die untersuchten Eisenoxid Nanopartikel wurden von Endothelzellen aufgenommen und zeigten im relevanten Konzentrationsbereich keine Zytotoxizität. Unter diesen Bedingungen wurden jedoch Zelltyp-spezifische biologische Effekte festgestellt, wie die Abnahme der Impedanz, die auf eine Veränderung der Barriere-Eigenschaften der Zellen schließen lässt.

Zudem wurde in diesem Projekt ein komplexes, multizelluläres in vitro Model der intestinalen Barriere etabliert, mit dem die Auswirkungen der Nanopartikel untersucht wurde (siehe auch AP3). Für dieses Cokultur-Modell wurden die intestinale Epithel-Zellline Caco-2 zusammen mit den mikrovaskulären Endothelzellen ISO-HAS-1 verwendet. In diesem System erwiesen sich die eingesetzten Nanopartikel weder als toxisch noch entzündungsauslösend.

Weiteres Ergebnis der Arbeiten war der Nachweis, dass die Ausbildung der Nanopartikel Proteinkorona einen entscheidenden Faktor für (nano)-medizinische und -biotechnologische Anwendungen darstellt. Die zeitaufgelöste quantitative Analyse der Proteinkorona zeigte, dass sich die Proteinhülle extrem schnell bildet, hochkomplex zusammengesetzt ist und Nanopartikel Toxizität oder die intrazelluläre Aufnahme der Nanopartikel beeinflusst.

Nach der Aufnahme lagen die verwendeten Partikel in allen eingesetzten Zelltypen in Lysosomen vor, was auf einen Aufnahmemechanismus mittels Endozytose bzw. Phagozytose hindeutet. Die Nanopartikel lagen nach Aufnahme topologisch außerhalb des Zytosols vor und können dieses erst nach Durchdringen der Vesikel-Membran erreichen. Eine Aufnahme von Partikeln in den Zellkern von Darmepithelzellen wurde nicht festgestellt.

Im AP 4 wurde in vivo im Mausmodell die biologischen Auswirkungen nanoskaliger Kontrastmittel analysiert. Keine der getesteten Partikelsuspensionen verursachte eine signifikante Organtoxizität im Mausmodell. Auch alle getesteten Serumparameter waren unauffällig. Die Verteilung der Partikel nach oraler Gabe wurde mittels Magnetresonanztomographie (MRT) und Computertomographie (CT) analysiert. Zusätzlich wurden Elementanalysen und Elektronenmikroskopische Untersuchungen an den Organen durchgeführt. Ca. 95% der verabreichten Menge der Nanopartikel Suspensionen wurde direkt wieder ausgeschieden, während der größte Teil der restlichen 5% konnte durch Spülung mit Pufferlösung aus Magen, Dünndarm und Rektum entfernt werden. Für den Organismus bedeutet dies, dass weniger als 0.5% der eingesetzten Partikeldosis im Körper verblieben ist.

Im AP5 wurden verschiedene Elemente der Bildanalyse etabliert und entwickelt, die auf die Ergebnisse der Mikroskopie-Daten angewendet werden konnten. Durch die Anwendung maßgeschneiderter Bildanalyse-Methoden konnte die dreidimensionale Struktur der Zellmembran und des MT-Netzwerks rekonstruiert werden. Das im AP5 entwickelte Simulationsmodell berücksichtigt verschiedene Aufnahmemechanismen an der Zellmembran und die Dynamik der Nanopartikel in verschiedenen Zellkompartimenten. Die Analyse der MT-Struktur legt einen Einfluss der Nanopartikel auf die Persistenzlänge des MT-Netzwerks nahe.

Grundlegende Ergebnisse der durchgeführten Untersuchungen sind:

• Nanoskalige Kontrastmittel werden vom Großteil der getesteten Zelllinien aufgenommen (Darmepithelzellen, Endothelzellen und Makrophagen).
• In vitro und in vivo konnte für die getesteten Systeme in der Regel keine organ-, zytotoxische oder entzündungsauslösende Wirkung beobachtet werden. Ausnahmen stellen die Aktivierung und Verstärkung inflammatorischer Signalwege in Makrophagen durch Silica-Referenzpartikel, sowie das leicht inflammatorische Potential von Gd-dotierte BaSO₄ Nanopartikel in Caco-2 Monokulturen dar.
• Die Anwesenheit proteinhaltiger biologischer Medien führt in Abhängigkeit von der Partikeloberfläche zu einer Proteinkorona, welche das physikochemische und biologische Verhalten der Partikel beeinflusst.
• Gd-haltige BaSO₄ –Suspensionen zeigten in vitro und in vivo eine gute Röntgenkontrastierung, jedoch in vivo einen geringen MRT –Kontrast.
• Der Zusammenhang zwischen der Struktur des membrannahen Aktin-Netzwerkes und der Partikeldynamik konnte bestimmt werden.
• Es wurde gezeigt, dass die Aufnahme von Nanopartikel die Persistenzlänge der MT-Filamente beeinflusst.